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发酵工艺:工程菌(大肠杆菌)高密度发酵主要影响因素说明(重组

发布时间:2021-03-31 11:03

基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素,包括重组菌构建、培养条件、生长。通酵可提高细胞长密蛋白的含量。在高一些通过响。

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重组大肠杆菌构建的几个影响因素

1.1

宿主菌的选择

的大存在别。BL21(DE3)plysS因其带有编T7溶菌酶而有效降低杂蛋白的表达,但不影IPTG蛋白平,而成近年最为用的宿主表达产物的成在大肠杆径:第形成稳的天然构可溶且性的状态识别解;第宿主菌的选择表达及下用。

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1.2

质粒载体

肠杆达也产生了很大影响。常用的基表达载体pETpSCpPBBpUC以及由它们衍生的一体。粒载稳定宿主菌状况生长环境影响而且还自身遗传特性。质粒载体的贝数并不是有些隆的码基因数质作载体含量高会主细陈代活动。质粒不以下种情况:(1稳定性;(2)。另外境条也会质粒拷贝数如葡萄糖、NH4+等因子的限量供应以及pH的变化都会引起质粒拷贝数的下降

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培养条件(营养源、控制条件)

2.1

营养源  

密度酵要获得高生物量和浓度表达于生物量基质以满足细迅速长繁殖及大表达基因产的需使的培合成培养培养各组分的浓度比例的营养物质反会抑制菌体的。葡(Glu)因细利用易得已被广泛用重组菌高密度的限制性基质。Glu控制10g/L20g/L将会制细胞的生长。同时人用油代Glu细菌生的碳以减代谢——乙酸的积累,更易达到重组菌的高密度和外源蛋白的高表达。NO3-、胰蛋白胨(Tr)、酵母提取物(Ye)氮源有于细胞的生长。

2.2

控制条件 

2.2.1

接种量  

量大累都重要作接种量对基因表达的影不大体生长影较明。接种量小(0.5%-4%)生长速对数生长持续时接种(>8%)细菌快地达到了稳,持间短4%

2.2.2

溶氧浓度 

浓度一。与,生长产物成的大,过低会影细菌谢。中,由于体密度高,发大,搅拌速和增加溶量。酵时的延长,加,之下降。此在高度。

水平但可能导致局部混合不匀,使毒;在菌体中隆具有提高氧递能(VHB)基中H2O2,利宿的过氧化酶分解产生O2氧的分压。

2.2.3

pH值  

pH使保持最生长状件。pH变化会变菌体内的pH影响的代谢进而影的生物量和基因产物的表达。Ecoli发酵时产(主要)致发酵液pHCO2H2O作用会导pH值的降低。细胞产大量的乙酸CO2使pH低。pH使之处于HpH烈变化细胞生利影响。

菌体生长和产物合成过程中,常用于控制pH的酸碱有HClNaOH和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有补充氮源的作用。但有研究发现,NH4+浓度对大肠杆菌的生长有很大影响,当NH4+浓度高于170mmol/L时会严重抑制大肠杆菌的生长。

2.2.4

温度  

培养温度是影响细菌生长和调控细胞代谢的重要因素。较高的温度有利于细菌的高密度发酵,低温培养能提高重组产物的表达量,而且在不同培养阶段采用不同的培养温度有利于提高细菌的生长密度和重组产物的表达量,并可缩短培养周期。但细胞生长的温度突然升高细胞内就会生成某些热激蛋白,以适应变化的环境,外源蛋白相对量降低,给后续的纯化造成困难。如果温度升高的范围不太大,热激蛋白合成的速度会很快下降,恢复正常蛋白的合成。对于采用温度调控基因表达或质粒复制的重组菌,发酵过程一般分为生长和表达两个阶段,分别维持不同的培养温度。但也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重组蛋白量。

2.2.5

诱导剂及诱导时间控制 

乳糖基因(lac)及其衍生的启动子被广泛地应用于重组蛋白在大肠杆菌表达系统中进行表达生产。这类启动子通常都用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂进行外源蛋白的表达,但它成本高,污染环境,因而不适于工业生产。已有人用乳糖代替异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)做为诱导剂或者以一定比例混合,诱导外源蛋白的表达。

诱导剂的添加量及诱导时菌体密度的高低都会影响到外源蛋白的表达水平。浓度较低时,外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的升高而不断升高;当浓度超过一定限度时,就会影响菌体代谢及蛋白表达水平。

诱导时间的选择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。

2.2.6

补料控制  

重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键在于补料策略,即采用合理的营养流加方式。常用的流加模式:非反馈补料,反馈补料,其主要工作原理见下表。

了补料技的影响外基成及补时间的源基是至重要



生长抑制因子(乙酸、二氧化碳)

3.1

乙酸的积累  

Glu为碳源的大肠杆菌的生长,常伴随着乙酸的分泌,进而影响细胞生长和蛋白表达。乙酸的分泌可以通过维持较低浓度的Glu来减少合代谢。当残留的Glu浓度<1g/L和乙酸浓度<2g/L时,不存在大肠杆菌细胞生长的抑制因子。

乙酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环有关。目前国外已有研究希望通过代谢工程改变重组大肠杆菌的代谢途径,从而降低乙酸的生成。

3.2

CO2的积累  

高密度发酵过程中,细菌代谢产物CO2的积累也会抑制外源蛋白的表达。因为CO2对菌体具有直接的毒害作用,而且溶解于发酵液中也会导致pH值的下降。有报道多变鱼腥藻可以利用CO2为碳源,进行高密度培养,这样可以消除CO2的抑制作用。



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